中草藥對(duì)弧菌的抑制作用研究論文
摘 要：目的 闡明現(xiàn)常用抑菌中草藥在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的用藥療效，為水產(chǎn)養(yǎng)殖細(xì)菌性疾病的防治提供用藥參考。方法 采用微量肉湯稀釋法測(cè)定了12種水產(chǎn)養(yǎng)殖常用的抗菌中藥產(chǎn)品對(duì)5株常見海洋致病菌的最低抑菌濃度(MIC)。結(jié)果 NZ方與市售“蝦倍健”抑菌效果最佳，對(duì)副溶血弧菌、嗜水氣單胞菌、創(chuàng)傷弧菌、哈維弧菌、溶藻弧菌的最低抑菌濃度在0.313～1.250 g/L，而其他市售抗菌中草藥大黃末、六味黃龍散、三黃散、根蓮解毒散、七味板藍(lán)根散、大蒜素、病毒速滅亡、穿梅三黃散、白頭翁口服液、健肝寶和地錦草末對(duì)5種海洋致病菌抑制濃度均大于40.000 g/L。 結(jié)論 給水產(chǎn)養(yǎng)殖細(xì)菌性疾病的防治提供了用藥建議及使用參考。
關(guān)鍵詞：NZ方; 弧菌; 中草藥
近年來，隨著對(duì)蝦疾病的爆發(fā)越來越頻繁，我國對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)特別是華南地區(qū)的對(duì)蝦養(yǎng)殖受病害肆虐情況嚴(yán)重，部分地區(qū)對(duì)蝦幼體患病死亡率達(dá)100%，給殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，如何有效防治對(duì)蝦病害侵襲也倍受水產(chǎn)業(yè)界人士關(guān)注和重視[1-2]。蝦的紅體、偷死、肌肉白濁、爛眼爛鰓、熒光、黑斑等癥狀多由弧菌及嗜水氣單胞菌引起，而根據(jù)上述病癥，農(nóng)業(yè)部“用藥指導(dǎo)”也給出相關(guān)的用藥建議。其中，大黃末、地錦草等被廣泛推薦應(yīng)用。根據(jù)現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)，抗菌類中藥制劑有38種，筆者選取其中最為常用的.12種中藥制劑與NZ方對(duì)5株常見的海洋致病菌進(jìn)行體外抑菌作用的比較，為水產(chǎn)養(yǎng)殖細(xì)菌性疾病的防治提供用藥參考。
1 材料與方法
1.1 菌株
標(biāo)準(zhǔn)菌株：副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticuss，V.p);溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus，V.a);哈維氏弧菌(Vibro harveyi，V.h);創(chuàng)傷弧菌(Vibrio vulnificus，V.v);嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila，A.h)由中國南海研究所提供。
1.2 培養(yǎng)基
2216E 液體培養(yǎng)基(青島高科園海博生物技術(shù)有限公司)。2216E瓊脂培養(yǎng)基(青島高科園海博生物技術(shù)有限公司)。
1.3 藥物及其制備
NZ方(檵木葉、半邊蓮花、地膽草等8味)：由中藥開發(fā)研究所研制。大黃末：每1 kg飼料用本品5.0 g;六味黃龍散：每1 kg飼料用本品4.0 g。三黃散：每1 kg飼料用本品5.0 g;根蓮解毒散：每1 kg飼料加本品10.0 g。七味板藍(lán)根散;每1 kg飼料用本品2.5 g;大蒜素：每1 kg飼料用本品0.6 g。蝦倍健：每1 kg飼料用本品4.0 g;病毒速滅亡：每1 kg飼料，用本品20 mL。穿梅三黃散：每1 kg飼料用本品4.0 g;白頭翁口服液：每1 kg飼料用本品3 mL。健肝寶：每1 kg飼料用本品2.0 g;地錦草末：每1 kg飼料用本品10.0 g。分別取上述藥物16.0 g制備成100 mL藥液。
1.4 儀器
儀器：分析天平(BT211B，德國Sartorius公司);手提式壓力蒸汽滅菌鍋(OIJ2006-04，上海東亞壓力容器制造有限公司);雙人單面凈化工作臺(tái)(SW-CJ-2FD，蘇州凈化設(shè)備有限公司);恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)。
1.5 藥物配制
將受試藥物用適宜溶劑配制成0.8 g/ mL的藥液，高壓滅菌后，按二倍遞減濃度稀釋，共配制成11個(gè)梯度濃度的藥物稀釋液。
1.6 菌種復(fù)蘇與培養(yǎng)
將冷藏保存的菌種在瓊脂板上劃線培養(yǎng)復(fù)蘇24 h，再挑取生長良好的單菌落接種到裝有2216E肉湯培養(yǎng)基的搖菌管中，置恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期。
1.7 測(cè)量
以2216E肉湯作為空白對(duì)照液調(diào)零，在波長600 nm處測(cè)定菌懸液OD值，計(jì)算含菌數(shù)，并稀釋成1×106 CFU/ mL的菌懸液。
1.8 加樣孵育
按無菌操作吸取藥液和菌懸液各100 μl于96孔板第1-11孔中，第12孔加入配制溶劑和菌懸液各100 μl作陰性對(duì)照，置恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)20 h。
1.9 結(jié)果判讀
肉眼觀察，藥物最低濃度孔無細(xì)菌生長者，即為該試菌MIC值。難判斷者，可將該孔中培養(yǎng)液于無菌瓊脂板上劃線，37 ℃培養(yǎng)20 h后讀取結(jié)果。
2 結(jié)果與分析
NZ方與12種市售抑菌中藥品對(duì)5種危害較大的海洋致病菌的最低抑菌濃度的測(cè)定結(jié)果可知，蝦倍健抑菌濃度最低，抑菌效果最佳，對(duì)副溶血弧菌、嗜水氣單胞菌、創(chuàng)傷弧菌的最低抑菌濃度為0.313 g/L;對(duì)哈維弧菌、溶藻弧菌的最低抑菌濃度為1.250 g/L;穿梅三黃散次之，在5.000～40.000 g/L;而大蒜素、病毒速滅亡、根蓮解毒散的抑菌效果最差，均在40.000 g/L以上，見表1。
對(duì)12種藥品與NZ方的最低抑菌濃度及其標(biāo)示用量進(jìn)行比較，其中僅有蝦倍健標(biāo)示用量大于最低抑菌濃度，也就是說，按產(chǎn)品標(biāo)示用法用量，僅有蝦倍健能達(dá)到預(yù)期抑菌效果，見表2。
3 討論
根據(jù)上述研究結(jié)果顯示，市面上抗菌藥物種類繁雜，而養(yǎng)殖戶面對(duì)細(xì)菌感染疾病的爆發(fā)卻無可奈何，盲目用藥，直接損害了養(yǎng)殖戶的利益[6-7]。在筆者隨機(jī)選取的10余種常用抗菌中藥的實(shí)驗(yàn)結(jié)果看來，情況令人堪憂，這些在養(yǎng)殖過程中的應(yīng)用十分廣泛的藥品，在對(duì)其進(jìn)行的最低抑菌濃度試驗(yàn)中其最低抑菌濃度根本無法達(dá)到抑菌防治效果[8]。
隨著抗生素在水產(chǎn)養(yǎng)殖的廣泛使用。近年來，耐藥菌的不斷產(chǎn)生，養(yǎng)殖戶對(duì)細(xì)菌性疾病的爆發(fā)束手無策，給養(yǎng)殖業(yè)帶來重大的損失，中草藥以其安全、副作用小、無耐藥性等獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，逐漸成為研究和開發(fā)的熱點(diǎn)，市面上標(biāo)榜抗菌的中草藥五花八門，但加工粗糙，質(zhì)量良莠不齊，夸大藥效，導(dǎo)致養(yǎng)殖戶用藥無效，對(duì)中草藥產(chǎn)品失去信心[9-11]。
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