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    開口箭活性部位抗腫瘤細胞作用研究論文

    時間:2021-06-13 13:34:03 論文 我要投稿

    開口箭活性部位抗腫瘤細胞作用研究論文

      1 材料與儀器

    開口箭活性部位抗腫瘤細胞作用研究論文

      1.1 細胞株人宮頸癌細胞(Hela)、人肝癌細胞(HepG2)均由三峽大學分子生物學研究所提供。

      1.2 藥品與儀器RPMI-1640為美國GIBCO公司產(chǎn)品;新生小牛血清為杭州四季青生物材料有限公司產(chǎn)品;HEPES為美國Sigma公司產(chǎn)品;胰蛋白酶為美國GIBCO公司產(chǎn)品;四氮唑藍(MTT)為美國AMRESCO公司產(chǎn)品;環(huán)磷酰胺 (CP,江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司,批號:07020121)。酶聯(lián)免疫檢測儀(GENIOS TECAN);CO2培養(yǎng)箱(日本三洋公司);LD4-2A離心機(北京醫(yī)用離心機廠);96孔板(美國Cornning公司)。開口箭根莖于2002-07采自湖北省神農(nóng)架林區(qū),經(jīng)三峽大學化學與生命科學學院陳發(fā)菊副教授鑒定為Tupistra chinensis Bak.,標本存放于湖北省天然產(chǎn)物研究與利用重點實驗室(No.TC200207SNJ)。

      2 方法

      2.1 藥物制備開口箭根莖粉碎后,用甲醇回流提取,合并提取液,濃縮后經(jīng)氯仿脫脂后用水飽和的正丁醇萃取,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收正丁醇,濃縮液抽干后即得到開口箭總皂苷,配成水液,過大孔樹脂柱,水洗, 30%乙醇、70%乙醇、95%乙醇梯度洗脫,得開口箭4部分皂苷。分別取開口箭總皂苷、30%開口箭皂苷、70%開口箭皂苷兩個樣品,用PBS配制成所需濃度,依次為312.5,625,1 250,2 500,5 000,10 000 μg/ml, 70%開口箭皂苷用PBS配制成所需濃度,依次為156.25,312.5,625,1 250,2 500,5 000 μg/ml,所有受試樣品均用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌。環(huán)磷酰胺 (CP)用DMSO將其配置為500 mg/ml。

      2.2 細胞培養(yǎng) Hela和HepG2細胞用RPMI-1640培養(yǎng)液(另加10mmol/L HEPES、2.0 mg/mlNaHCO3、100 U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素和10%新生小牛血清),于CO2孵箱中37℃,5%CO2飽和濕度下培養(yǎng)。貼壁細胞用0.25%胰蛋白酶消化傳代。

      2.3 開口箭活性部位對Hela和HepG2細胞殺傷作用最佳實驗條件的選擇MTT法實驗條件的初步優(yōu)化,主要是對溶解藥物的.溶劑(水、PBS)、加藥前的培養(yǎng)時間(6,12,24 h)、藥物劑量和細胞密度進行了摸索。其中密度細胞分別取0.1×105,0.5×105,0.8×105,1×105個/ml,接種于96孔培養(yǎng)板,每孔接種100 μl,轉(zhuǎn)板24 h后加不同濃度的開口箭活性部位,繼續(xù)培養(yǎng)48 h,以MTT法測定吸光度,比較不同細胞密度的線性關系。

      2.4 MTT比色法[6]MTT比色法按Mosmann氏法略加改進。將處于對數(shù)生長期的細胞制成單細胞懸液,調(diào)整細胞濃度為0.5×105個/ml,接種于96孔培養(yǎng)板,每孔接種100 μl,轉(zhuǎn)板24 h后加100 μl受試藥,另設陰性對照組(不加藥)、空白調(diào)零組(只有PBS)和陽性對照組(環(huán)磷酰胺組),每組均設3個復孔,培養(yǎng)48 h,吸棄上清后加MTT(5 mg/ml)100 μl,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后,棄去上清液,加DMSO 100 μl,用全自動酶聯(lián)免疫檢測儀于570 nm波長處測定吸光度(OD)值[7],求出IC50。抑制率(%)=[陰性對照A570- 加藥組A570]/ 陰性對照A570×100%。

      2.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡和細胞周期分1×106個細胞于培養(yǎng)瓶,陰性對照組0.5×106個細胞每瓶,培養(yǎng)24 h;吸棄部分上清后加藥混勻(開口箭總皂苷、30%皂苷終濃度2 500μg/ml,70%皂苷和環(huán)磷酰胺終濃度1 250 μg/ml),繼續(xù)培養(yǎng)48 h;于5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后,收集上清于相應標簽離心管中,各加1 ml胰酶消化,加4 ml培養(yǎng)液于該培養(yǎng)瓶中,并一起吸至各相應離心管中,各瓶加入5 ml PBS洗滌,洗滌液一起吸入相應離心管中,以2 000 r/min離心5 min;吸棄上清,加入1 ml 80%乙醇和0.5 mmol/LEDTA(Na)2的PBS混合液懸起細胞,輕輕混勻,于4℃固定30 min;棄上清,加PBS 10 ml混勻,以2 000 r/min離心5 min;用500 μl含0.1%TritonX-100 和50 μg/ml RNase的PBS懸起細胞,轉(zhuǎn)置測定管中,加溴化丙錠PI 100 μl,避光染色17 min(一般15~20 min);濾膜過濾后上機。

      3 結果

      開口箭活性部位對Hela和HepG2細胞殺傷作用最佳實驗條件的選擇為了得到相對穩(wěn)定并且可靠的實驗結果,通過前期預實驗并結合大量資料,對該MTT法實驗條件進行了初步優(yōu)化,主要是對溶解藥物的溶劑、加藥前的培養(yǎng)時間、藥物劑量和細胞密度進行了探索。對于溶劑,最初采用的溶劑是水,通過對照發(fā)現(xiàn)溶解藥物的水對細胞的影響很小,但并非沒有,所以正式實驗采用PBS溶解藥物;對于加藥前的培養(yǎng)時間采用了6,12,24 h 3個時間,通過顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)加藥前培養(yǎng)24 h細胞狀態(tài)良好,由此選用了加藥前培養(yǎng)24 h;

      對于藥物劑量,通過多次預實驗,最終選擇了最高濃度開口箭總皂苷、30%皂苷為10 000 μg/ml,70%皂苷為5 000 μg/ml,而環(huán)磷酰胺為20 000 μg/ml;對于細胞密度,通過多次預實驗,采用5種細胞密度即0.1×105,0.5×105,0.8×105,1×105個/ml,同樣的藥物濃度情況下,開口箭活性部位對Hela細胞生長抑制呈最好線性關系的細胞密度是0.5×105 個/ ml,由此選擇最佳細胞濃度是0.5×105個/ml。通過這些因素的優(yōu)化,從而初步排除了其他非藥物因素對細胞的影響;而且這兩種腫瘤細胞的MTT實驗在同一批進行實驗,排除了不同環(huán)境的干擾,從而得出實驗結果。

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